llumina二代測序技術介紹

llumina二代測序技術，邊合成邊測序（SBS），是廣泛采用的新一代測序（NGS）技術，負責產生世界上90％以上的測序數據。

Illumina的二代測序技術稱為邊合成邊測序(Sequencing-by-Synthesis,簡稱SBS)。SBS主要包括堿基延伸、熒光激發及信號收集、剪切等3個步驟。這3個步驟可以重復，循環進行。每循環一次測定一個堿基。想測定多少個堿基（即讀長），就循環多少次。測序循環次數可以在軟件里設定。到底測序多長合適，要根據項目性質和需求來決定。大多數情況下，SR實驗（單端測序）測定1x50個堿基，PE實驗（雙端測序）測定2x150個堿基。

1 堿基延伸

Illumina測序試劑里所使用的dNTP特色，它們同時具有兩個修飾基團：一個熒光基團，一個可逆終止基團。A、G、C、T 4種堿基分別標記4種不同的熒光基團，它們在不同波長的激光激發下，能夠發射不同波長（即顏色）的熒光。熒光顏色與堿基種類一一對應，因此根據激發光的波長可以識別堿基。4種堿基的終止基團是一樣的。由于終止基團的存在，所有dNTP每次都只能延伸1個堿基，無論給予多長的反應時間。又由于該終止基團是可逆的，在熒光信號收集完畢之后，可以用剪切劑切除該終止基團，使堿基恢復自然的可延伸狀態，這時即可繼續進行下一輪循環，再測定一個堿基。

可逆終止基團技術是Illumina二代測序的一大特色。它與橋式PCR技術一起，構成了Illumina二代測序的兩大支柱，為穩定獲得高質量的測序數據打下了堅實的基礎。

2 信號采集

HiSeq系列測序儀具有紅綠兩根激光管，兩個濾色片。它們兩兩組合，可以形成4種不同的激發波長，正好分別用于激發A、G、C、T 4種堿基。

Cluster上所標記的熒光基團在激光激發下產生的信號，可以用相機拍攝或者掃描的方式收集信號。掃描技術速度比較快，被X10系列采用。由于FC面積比較大，而且上表面和下表面要分別拍照，所以拍照過程相當耗時。對于經典的HiSeq 2000來說，一次測序循環所產生的熒光信號，需要大約40分鐘的時間才能拍照收集完畢，時間比測序反應本身還要長。

3 剪切

熒光信號收集完畢后，關閉激光，用剪切劑去除測序引物的延伸產物上的堿基所標記的熒光基團和終止基團。兩個修飾基團均被切除，一方面消去干擾熒光，一方面使鏈末端的堿基回復到自然的可延伸狀態，為下一輪測序做好準備。

再重復合成、激發、收集等步驟，即可進行第二個堿基的測序。

測序循環可以重復多次。理論上可以一直重復，直到信噪比降低得無法有效識別堿基信號為止。由于熒光基團的發光效率持續不斷在衰減，Taq酶的活性也在持續不斷地衰減，所以實際上測序循環次數是有限的，大重復次數與sbs試劑的配方有關。測序的循環次數可以在軟件設置過程中人為，這個重復次數就是每個測序片段的讀長。目前，Illumina平臺的讀長有2x100 bp，2x125 bp，2x150 bp，2x300 bp等多種，其中2x150 bp用得較廣泛。

單端測序：單端測序(Single-read)首先將DNA樣本進行片段化處理形成200-500bp的片段，引物序列連接到DNA片段的一端，然后末端加上接頭，將片段固定在flow cell上生成DNA簇，上機測序單端讀取序列。

雙端測序：雙端測序(Paired-end)方法是指在構建待測DNA文庫時在兩端的接頭上都加上測序引物結合位點，在*輪測序完成后，去除*輪測序的模板鏈，用對讀測序模塊(Paired-End Module)引導互補鏈在原位置再生和擴增，以達到第二輪測序所用的模板量，進行第二輪互補鏈的合成測序。

基因組文庫是指將某生物的全部基因組DNA切割成一定長度的DNA 片段克隆到某種載體上而形成的集合?；蚪M文庫根據DNA 來源又分為核基因組文庫、葉綠體基因組文庫及線粒體基因組文庫。基因組文庫構建時遺傳信息供體是基因組DNA,因而無發育時期及組織器官特異性，在一個*的基因組文庫中包含著基因組DNA 上的所有編碼區及非編碼區序列的克隆; 生物有機體的每一個基因在文庫中都有其克隆，該克隆的基因片段里包括著間隔序列，所以基因組文庫可真實地顯示基因組的全部結構信息。

基因組文庫(Genomic Library)定義:把某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體貯存在一個受體菌克隆子群體中，這個群體即為這種生物的基因組文庫。

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